Vectores de Bacteriófagos λ:

A quando o fenómeno da infecção (transfecção) do DNA do fago para o interior da bactéria, este pode seguir dois ciclos de vidas diferentes: ciclo lítico e ciclo lisogénico.

• Ciclo de vida lítico: o DNA ao ser transfectado para o interior da bactéria não irá sofrer a integração no genoma da mesma e, como tal, irá utilizar o metabolismo da bactéria para sintetizar proteínas que irão compor o fago. Isto, leva a que, ao fim de uma divisão celular ocorra a formação e a libertação (lise da célula) dos mesmos.
• Ciclo de vida lisogénico: o DNA ao ser transfectado será introduzido no genoma da bactéria e, como tal, será replicado ao longo das sucessivas divisões, juntamente com todo o material genético da bactéria (de geração em geração). Após isto, o ciclo de vida lisogénico é terminado pela utilização dos “processos” descritos no ciclo de vida lítico, resultando numa libertação massiva de bacteriófagos.

No ponto de vista da Eng. Genética, seria muito mais vantajoso se fosse possível direccionar o ciclo de vida para uma fase lítica, de forma a obter o máximo de fagos (com o DNA recombinante) no menor tempo possível. Isto é possível através da eliminação do gene que confere a incorporação do DNA do fago no genoma da bactéria, na sequência que representa o genoma do Bacteriófago λ. Esta técnica, para além de “direccionar” o ciclo de vida, torna possível a inserção de uma maior molécula de DNA (comparativamente aos vectores de plasmídeos).

O genoma de λ para além de ser uma molécula linear, apresenta fins coesivos (cos sites), característica “diagnóstica” do DNA viral. Como estas pontas apresentam propriedades coesivas, dependendo da forma como se liguem, podem originar: concatámeros (molécula de DNA linear) e os cósmidos (molécula de DNA circular).

Formação de concatámeros:

Como referido anteriormente, a molécula de DNA λ possuí a forma linear e, quando tratada com uma determinada enzima de restrição, será clivada originando “Left cos site” e um “Right cos site”. Por sua vez, se fizermos um corte na molécula que queremos recombinar, utilizando a mesma enzima de restrição e pela acção das ligases é possível formar: Left cos site – DNA interesse – Right cos site. Por sua vez, como cada sequência apresenta fins coesivos entre si, é possível originar um fragmento de DNA em que o gene que pretendemos clonar, surge de sob a forma de cópias múltiplas e sequencial, intercalado com os diferentes “cos site”:

Left cos site- DNA – Right Cos site – Left cos site – Right cos site – DNA – Left cos site

A propriedade “cos site” é de extrema importância na utilização do vector de bacteriófago, uma vez que, promove a formação espontânea de fagos in vitro a partir de proteínas que constitutem a cápsula (empacotamento in vitro.).

A quando do empacotamento in vitro ocorre uma clivagem do fragmento de DNA λ , de modo a que: todas as sequências de DNA que eles empacotem sejam recombinada (Left cos site – DNA – Right cos site) uma vez que a sequência Left cos site – Right cos site é pequena de mais para sofrer o empactomento. É então possível definir que um fragmento de DNA só pode ser empacotado in vitro se: conter em cada terminal um cos site e for composto por 37 a 52 pares de base.

Após a transfecção dos vírus para o interior das bactérias, devemos proceder ao plaqueamento da suspensão (bactérias + vírus) para uma placa de petri, formando assim uma camada homogénea de bactérias. Neste ponto, devemos ter em consideração que:

• Zonas onde não há formação de placas fágicas: não há presença do DNA λ, uma vez que, não ocorreu lise celular.
• Zonas onde há formação de placas fágicas: surgem como “pontuações” onde ocorre lise celular e, como tal, estaremos na presença de DNA λ. A partir destes discos “brancos” é possível extrair e purificar inúmeras cópias do DNA recombinante.

Formação de cósmidos:

O cósmido é uma molécula de DNA circular que é obtida a partir do genoma de λ. Isto é, os cos sites em vez de se complementarem com outros fins coesivos, após a recombinação com um fragmento de DNA de interesse (utilizando a mesma enzima de restrição em ambos os cortes) vão ligar-se entre si, formando uma molécula de DNA circular contendo o gene de interesse e um locus cos site.

Esta, como apresenta cos site pudera sofrer o empacotamento in vitro originando fagos λ contendo a moléucula de DNA circular “recombinada”. Porém, como esta molécula é de grandes dimensões não será tida em conta como um fragmento de DNA viral, sendo no entanto, mantida no citoplasma como DNA plasmideal.

De salvaguardar que, este plasmídeo é diferente do vector plasmídeal utilizado em bactérias, uma vez que apresenta a possibilidade de inserção de um fragmento de maiores dimensões comparativamente a um vector bacteriano.